Kete Mutagenesis Arataki Pae Tere

Tauira A-1

■ Kei roto i te tauira he parenga pararau he Taq aukati ranei, me era atu.

■ Kaore i oti te taatai ​​o te tauira --— Ka tika te whakanui ake i te paemahana taangata me te whakaroa i te waa whakaheke.

■ Te whakaheke i te Tauira ——Whakaarahia te tauira.

A-2 Tuatahi

■ Te ngoikore o te kounga o nga tiimatanga ——Te whakahou i te tuatahi.

■ Te whakahekenga Tuatahi ——Whakaitihia te timatanga kukume teitei ki te rahinga iti hei whakaora. Aukati i te maha o te hukapapa me te rewa o te wa-roa kia 4 ° C ranei kia whakawhiwhia.

■ Te hoahoa tika o nga tiimatanga (hei tauira, kaore e rawaka te roa o te tiima, he iti ake te ahua i waenga i nga tiimatanga, me etahi atu.)

A-3 Mg²⁺kukū

■ Mg²⁺ he iti rawa te kukume ——Tika whakarahi i te Mg²⁺ kukū: Arotautia te Mg²⁺ kukume na te raupapa urupare mai i te 1 mM ki te 3 mM me te waahi 0.5 mM ki te whakatau i te Mg tino pai²⁺ kukū mō ia tauira me te tuatahi.

A-4 Te taumaha o te pāmahana

■ Ko te nui o te mahana whakakapinga e pa ana ki te here o te tuatahi me te tauira. ——Whakaitihia te paemahana whakakotahitanga ka arotahi ki te ahua kia 2 ° C.

A-5 Taima toronga

■ Te wa poto toronga —— Whakanuia te waa whakaroanga.

Phenomena: Ko nga tauira kino e whakaatu ana i nga raina raupapa whaainga.

A-1 Whakakorenga o te PCR

■ Whakapoke i te raupapa whaainga, ki nga hua whakarahinga ranei—— Kia tupato kaua e pipitihia te tauira kei roto te raupapa whaainga i te tauira kino ka rukuhia atu ki waho o te ngongo centrifuge. Ko nga reagents me nga taputapu ranei kia autoclaved ki te whakakore i nga waikawa karihi o mua, a ko te noho o te paru me whakatau i roto i nga whakamatautau kino kino.

■ Whakakorenga reagent ——Whakaahuahia nga reagents ka penapena i te paemahana iti.

A-2 Pirimiar

■ Mg²⁺ he iti rawa te kukume ——Tika whakarahi i te Mg²⁺ kukū: Arotautia te Mg²⁺ kukume na te raupapa urupare mai i te 1 mM ki te 3 mM me te waahi 0.5 mM ki te whakatau i te Mg tino pai²⁺ kukū mō ia tauira me te tuatahi.

■ He huatahi te hoahoa tuatahi, ana ko te raupapa whaainga he homology me te raupapa kore-whaainga. ——Timua-hoahoa hou.

Phenomena: Ko nga roopu whakarei i te PCR kaore e rite ki te rahi e hiahiatia ana, he rahi, he iti ranei, i etahi wa ka puta etahi taura whakarahi motuhake me nga roopu whakanui-kore.

A-1 Paraimere

■ He koretake te whakatikatika

——Timua-hoahoa tuatahi.

■ He tiketike rawa te kukume tuatahi --—Taapiki whakaniko i te paemahana whakaheke me te whakaroa i te waa whakaheke.

A-2 Mg²⁺ kukū

■ Te Mg²⁺ he tiketike rawa te kukume ——Titohia te whakaiti i te kukume Mg2 +: Arotautia te Mg²⁺ kukume na te raupapa urupare mai i te 1 mM ki te 3 mM me te waahi 0.5 mM ki te whakatau i te Mg tino pai²⁺ kukū mō ia tauira me te tuatahi.

A-3 Tino polymerase

■ Te nui o te hauhautanga whaainga —— Te whakaiti i te nui o te whiu i te waatea o te 0.5 U.

A-4 Te taumaha o te pāmahana

■ He iti rawa te pāmahana whakauru ——Te tika ana whakapiki i te pāmahana annealing, whakamahia ranei te tikanga taatai ​​e rua nga waahanga

Nga huringa A-5 PCR

■ He maha rawa nga huringa PCR ——Whakaitehia te maha o nga huringa PCR.

A-1 Paraimere——Pituhikohikohikohikohikohikohikore ana— mahia ranei ko PCR ohanga.

A-2 Tauira DNA

—— Kaore i te ma te tauira ——Whakaarahia te tauira tango i te DNA me nga kete purea ranei.

A-3 Mg²⁺ kukū

——Mg²⁺ he tiketike rawa te kukume ——Titohia me whakaiti te Mg²⁺ kukū: Arotautia te Mg²⁺ kukume na te raupapa urupare mai i te 1 mM ki te 3 mM me te waahi 0.5 mM ki te whakatau i te Mg tino pai²⁺ kukū mō ia tauira me te tuatahi.

A-4 dNTP

——Te teitei rawa te kukume o dNTPs——Titihia te kukutanga o dNTP tika

A-5 Te taumaha o te pāmahana

——Te iti rawa te mahana o te whakamomona ——Te tika ana ka whakapiki i te mahana whakamanamana

Huringa A-6

——Te maha rawa o nga huringa ——Ataa te tau huringa

Ko te mahi tuatahi ko te kowhiri i te polymerase e tika ana. Kaore e taea e te polymerase Taq auau te whakatika na te korenga o te 3'-5 'mahi exonuclease, a na te kore taurite e tino whakaitihia te kaha o te whakaraatanga o nga kongakonga. Na reira, kaore e taea e te Taq polymerase noa te whakanui i nga waahanga whainga nui atu i te 5 kb. Ko te Taq polymerase me nga whakarereke motuhake, tetahi atu polymerase pono ranei, me tohu ki te whakapai ake i te kaha o te toronga, me te whakatutuki i nga hiahia o te waahanga kaha roa. Hei taapiri, ko te whakarahi i nga waahanga roa ka hiahia ano kia whakatikatika i te hoahoa tuatahi, te waa whakahekenga, te waa toronga, te buffer pH, me etahi atu. Hei aukati i te kino o te tauira, me whakaiti te waa whakaheke i te 94 ° C ki te 30 hekere iti iho ranei mo ia huringa, me te wa e piki ai te mahana ki te 94 ° C i mua i te whakarahinga kia iti iho i te 1 meneti. Ano hoki, ko te tautuhi i te mahana whakawhaanui mo te 68 ° C me te hoahoa i te waa whakaroanga kia rite ki te tere o te 1 kb / min ka taea te whakarite kia kaha te whakanui i nga waahanga roa.

Ka taea te whakaheke i te reanga hapa o te whakanui PCR ma te whakamahi i nga momo polymerases DNA me te pono pono. I roto i nga Taq DNA polymerases katoa i kitea i tenei wa, ko te Pfu enzyme te reiti hapa iti me te pono pono (tirohia te teepu piri). I tua atu i te whiringa o te whākōkī, ka taea e ngā kairangahau te whakaheke i te reanga irakētanga PCR mā te whakarerekē i ngā tikanga tauhohenga, tae atu ki te whakarerekētanga o te whakahanumi, te kukū o te polymerase wera me te whakanui i te tau huringa PCR.