TIANSeq Pee RNA-Seq Peke (illumina)

I tenei wa, ko te hangarau raupapa-whakaputa nui e hangai ana ki te hangarau whakatipuranga whakatipuranga. I te mea ko te roanga o te waa panui mo te hangarau whakatuihotanga o te reanga e iti ana, me huri e tatou te roanga o te roa ki roto i nga wharepukapuka iti o te waahanga. E ai ki nga hiahia o nga rereketanga whakaraupapa rereke, ko te tikanga ka kowhiri i te waahanga-takitahi, te raupapa-takirua ranei. I tenei wa ko nga kongakonga DNA o te whare pukapuka whakariterite whakatipuranga ka tohaina i te whānuitanga o te 200-800 bp.

a) He ngoikore te kounga o te DNA a kei roto i a ia nga aukati. Whakamahia nga tauira DNA kounga kairangi hei karo i te aukati i te ngohe ngongo.

b) Ko te rahinga o nga tauira DNA kaore i rawaka i te wa e whakamahi ana i te tikanga kore-PCR hei hanga whare pukapuka DNA. Ka nui ake te whakauru o te DNA marara ki te 50 ng, ka taea te whiriwhiri i te rerengamahi kore PCR i te wa o te hanganga whare pukapuka. Mena he iti rawa te nama kape o te wharepukapuka kia tika ai te whakaraupapa, ka taea e te PCR te whakakaha i te whare pukapuka DNA i muri i te hononga o te hononga.

c) Ko te whakapoke o te RNA e tika ana kia kore e tika te tatauranga o te DNA tuatahi, ka puta te poke RNA i roto i te mahinga purea o te genomic DNA, na teera pea ka tika te rahi o te DNA me te iti o te utaina o te DNA i te wa e hanga whare pukapuka ana. Ka taea te tango i te RNA ma te rongoa me te RNase.

A-1

a) Nga waahanga iti (60 bp-120 bp) ka puta ko nga waahanga iti ko nga waahanga paraoa ranei nga waahanga ka hangaia e nga kaitautoko. Te purea ma nga miihini aukume Agencourt AMPure XP ka taea te tango i enei waahanga urutau me te whakarite kia kounga te whakaraupapa.

b) He waahanga nui kei roto i te wharepukapuka whai muri i te whakarahinga PCR Ko te rahi o te waahanga DNA o te whare pukapuka ka piki ake i te 120 bp i muri o te hononga o te hononga. Mena ka piki te waahanga DNA neke atu i te 120 bp i muri o te hononga o te hononga, ka raru pea te waahanga o te PCR. Ko te whakaheke i te maha o nga huringa PCR ka aukati i te ahuatanga.

c) Te rahi o te rahi o nga waahanga DNA o te whare pukapuka i muri o te hononga adapter Ko te roa o te kaitautoko i tenei kete ko te 60 bp. Ka honoa nga pito e rua o te waahanga ki nga kaitautoko, ka roa noa te roa e 120 bp. Ki te whakamahi i te adapter i tua atu i te kohinga o tenei kete, tena koa whakapiri atu ki te kaiwhakarato ki te whakarato i nga korero whaitake penei i te roa o te adapter. Tena koa kia whai i te rerengamahi whakamatautau me te mahinga te whai i nga huarahi i whakaaturia i roto i te pukapuka.

d) Te rahi o te kongakonga DNA i mua i te hononga o te hononga adapter Ko te take o tenei raru ka hua pea na nga ahuatanga urupare he i te wa e pakaru ana te DNA. Me whakamahi nga wa rerekee rereke mo te whakauru DNA rereke. Mena he nui ake te whakauru DNA ki te 10 ng, ka tūtohu maatau kia kowhiri i te waa urupare o te 12 meneti hei tiimata mo te arotau, a ko te rahinga kongakonga i hangaia i tenei waa ko te nuinga o te 300-500 bp. Ka taea e nga kaiwhakamahi te whakarahi, te whakaheke ranei i te roa o nga waahanga DNA mo te 2-4 meneti kia rite ki a raatau ake whakaritenga ki te arotau i nga waahanga DNA me te rahi e hiahiatia ana.

A-2

a) Kaore i te maatauhia te waa hautanga Mena he iti rawa, he nui rawa ranei te DNA tohatoha, tirohia nga Aratohu mo te Wahanga Wahanga Whaariki i roto i nga tohutohu hei whakatau i te waa urupare, me te whakamahi i tenei waahanga hei mana whakahaere, me whakarite ano he te punaha urupare ki te whakaroa, ki te whakapoto ranei i te 3 meneti kia tika ake ai te whakatika i te waa wehenga.

A-3

Te tohatoha rahi rahi o te DNA i muri i te maimoatanga pakaru

a) Te tikanga rewa o te reagent reagent, kaore ranei te reagent i tino konatunatua i muri o te rewa. Kohia te 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagent ki runga i te huka. Kia rewa ana, whakaranuhia te reagent ma te piu ata i te raro o te ngongo. Kaua e kopikopiko te reagent!

b) Ko te tauira whakauru a te DNA kei roto ko te EDTA etahi atu poke ranei Ko te whakaheke i nga katote tote me nga kaihoko chelating i roto i te waahanga horoi DNA he mea nui kia angitu te whakamatau. Mena ka rewa te DNA ki te 1 × TE, whakamahia te tikanga i whakaritea hei tohutohu kia pai te tohatoha. Mena kaore i te maatauhia te kukume o te EDTA ki te otinga, me taunaki kia purea te DNA ka waihohia ki te wai kua whakahekehia hei whakautu i muri.

c) He tika te tatauranga o te DNA tuatahi Ko te rahi o te DNA whatiwhatinga e tata ana ki te rahinga o te urunga DNA. I mua i te wehenga o te wehenga, te rahinga tika o te DNA ma te whakamahi i te Qubit, te Picogreen me etahi atu tikanga hei whakatau i te rahinga o te DNA i roto i te punaha urupare.

 d) Ko te whakarite i te punaha tauhohenga kaore e whai i nga tohutohu Ko te whakarite i te punaha tauhohenga wehenga me kawe tonu i runga i te huka kia tika ki nga tohutohu. Kia pai ai te painga, me waiho nga waahanga tauhohenga katoa ki runga i te hukapapa me te whakarite i te punaha tauhohenga kia oti i muri i te raumati katoa. Ka mutu ana te whakarite, me huri ki te pipet ranei, kia pai ai te uru. Kaua e pupuhi!

1. Ko te tikanga whakaranu he (hengaru, he piwa tutu, me etahi atu) ka kino te tohatoha o nga waahanga o te wharepukapuka (e whakaaturia ana i te ahua e whai ake nei), ka pa ki te kounga o te wharepukapuka. No reira, i te wa e whakarite ana i te otinga tauhohenga Whakaranu Tiwariwha, me ata whakatere ki runga ka heke iho ki te whakaranu, te whakamahi ranei i te maihao o te matimati ki te piu me te uru taurite. Kia tupato kei uru ki te kohinga puoro.

2. Me tino whakamahi te DNA ma mo te hanga whare pukapuka

■ Te pai o te DNA: Ko te roopu electrophoresis he neke atu i te 30 kb, kaore he hiku

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Ko te nui o te whakauru ki te DNA me tika Te whakaaro kia whakamahia nga tikanga Qubit me te PicoGreen ki te tatau i te DNA, kaua ki te Nanodrop.

4. Ko nga korero o te EDTA i roto i te otinga DNA me whakatau ko te EDTA he mana nui ki te urupare whatianga. Mena he nui nga korero o EDTA, me mahi te horoi DNA i mua o te whakamatautau o muri mai.

5. Me whakarite te otinga tauhohenga whatianga i runga i te hukaa He ngawari te mahinga wehenga ki te mahana o te tauhohenga me te wa (ina koa i muri i te taapiri whakarei). Kia pai ai te tika o te wa whakautu, tena koa whakarite i te punaha urupare ki runga i te huka.

6. Ko te wa tauhohenga wawahi kia tika Te wa urupare o te waahanga taapiri ka pa tonu ki te rahi o nga hua waahanga, na reira ka pa te rahi o te tohatoha o nga waahanga DNA i roto i te wharepukapuka.

1. He aha te momo tauira e tika ana mo tenei kete?

Ko te momo tauira e tika ana mo tenei kete ko te RNA katoa, ko te mRNA kua oti te pure, me te pono o te RNA. Mena ka whakamahia te katoa o te RNA hei hanga whare pukapuka, e taunaki ana kia whakamahia te kete whakaheke rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) hei tango i te rRNA tuatahi.

2. Ka taea te whakamahi i nga tauira FFPE hei hanga whare pukapuka me tenei kete?

Ko te mRNA kei roto i nga tauira FFPE ka whakaitihia ki tetahi waahanga, me te ngoikore o te pono. I te wa e whakamahi ana koe i tenei kete mo te hanga wharepukapuka, e taunaki ana kia aroturukihia te waa waahanga (whakapotohia te waa waahanga, kia kaua ranei e mahi i nga waahanga).

3. Ma te whakamahi i te waahanga taapiri rahi i roto i te pukapuka a-hua, he aha te take i puta ai te waahanga kua whakauruhia kia paku ke te kotiti?

Ko te kohinga rahi ka whakatutukihia kia rite ki te taahiraa kowhiringa rahi o tenei pukapuka a-taonga. Mena he rereke te rereke, ko te take pea kaore i te taurite nga peara aukume ki te mahana o te ruuma kaore ano kia tino ranuhia, kaore i te tika te pipipe ka mau tonu ranei te wai ki te pito. E taunaki ana kia whakamahia nga tohutohu me te iti o te panui mo te whakamatautau.

4. Te kowhiringa o nga urutau ki te hanga wharepukapuka

Ko te kete hanga whare pukapuka kaore he reagent adapter, a e taunaki ana kia whakamahia tenei kete me te TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC o te whare pukapuka

Te kitenga o te wharepukapuka: Ko te Qubit me te qPCR e whakamahia ana hei whakatau i te kohinga papatipu me te kohinga molar o te wharepukapuka. Ko te mahi e tino rite ana ki te pukapuka a-hua. Ko te kukume o te wharepukapuka ka tutuki i nga whakaritenga o te raupaputanga NGS. Te kitenga o te awhe tohatoha whare pukapuka: Ma te whakamahi i te Agilent 2100 Bioanalyzer kia kitea te awhe tohatoha o te wharepukapuka.

6. Te kowhiri i te tau huringa whakaniko

E ai ki nga tohutohu, ko te maha o nga huringa PCR ko te 6-12, a ko te maha o nga huringa PCR e hiahiatia ana me tohu kia rite ki te whakauru tauira. I roto i nga wharepukapuka hua-nui, ko te whakanui i te nuinga o te waa ka puta i roto i nga tohu rerekee, e whakaatuhia ana e te tihi tino nui ake i muri o te tihi o te whaainga whaainga i te kitenga o Agilent 2100 Bioanalyzer, ko te kukutanga ranei o Qubit he iti iho i te qPCR. Ko te ngawari mo te whakarahinga he ahuatanga noa, kaore e pa ki te raupapa o te wharepukapuka me te wetewete raraunga o muri mai.

7. Ka puta mai nga koikoi i te tohu rapunga o Agilent 2100 Bioanalyzer

Ko te ahua o nga koikoi i te kitenga Agilent 2100 Bioanalyzer na te wehenga o nga tauira kaore e taurite, ka nui ake nga waahanga i etahi waahanga, ka tino kitea ake i muri o te whakarangatira PCR. I tenei keehi, ko te whakaaro kia kaua e mahi i te waahanga rahi, arā, me whakarite ki te 94 ° C mo te 15 meneti kua whakauruhia, he iti te waahanga o te waahanga, ka taea te whakapai ake i te homogeneity.