Tere Tere Kotahi Hipanga RT-PCR Kete

Kua whakaitihia te A-1 RNA

—— Whakapaihia te RNA kounga teitei kaore he poke. Ko nga rauemi i tangohia mai ai te RNA kia hou kia taea ai te aukati i te whakahekenga RNA. Te wetewete i te pono o te RNA i runga i te gel kua whakaatuhia i mua i te urupare RT. I muri i te tangohanga RNA, me penapena i roto i te 100% formamide. Mena ka whakamahia te aukati RNase, kia <45 ° C te paahana whakawera, kia iti iho te pH i te 8.0, ka kore ka tukuna e te kaitautoko te RNase here katoa. Ano hoki, me taapiri te aukati RNase i nga rongoā kei roto i te 8 0.8 mM DTT.

Ko te A-2 RNA he aukati i nga tauhohenga whakawhiti whakamuri

——Whakaahua te aukati i nga tuhinga haangai tae atu ki te SDS, EDTA, glycerol, te konutai pyrophosphate, te spermidine, te formamide, te tote guanidine, me etahi atu. Whakaranuhia te RNA mana me te tauira, ka whakataurite i te hua me te urupare a te RNA ki te tirotiro mena kei te aukati tetahi. Horoihia te rerenga o te RNA me te 70% (v / v) te etanol hei tango i nga aukati.

A-3 He iti rawa te whakahiatotanga primers e whakamahia ana mo te whakakotahi i te whenu tuatahi o te cDNA

——Tohu e tika ana te mahana o te whakamomona ki nga timatanga e whakamahia ana i te whakamatautau. Mo nga hexamers matapōkere, e taunaki ana kia noho te pāmahana ki te 25 ° C mō te 10 meneti i mua i te paunga ki te pāmahana urupare. Mo nga whakatupatotanga motuhake-a-ira (GSP), ngana ki etahi atu GSP, ka huri ranei ki te oligo (dT), te hexamer tupurangi ranei.

A-4 Itinga iti o te tiimata o te RNA

—— Whakarahihia te nui o te RNA. Mo nga tauira RNA iti iho i te 50 ng, 0.1 μg ki te 0.5 μg acetyl BSA ka taea te whakamahi i te whenu tuatahi cDNA

A-5 Ko te raupapa whaainga kaore i te whakaatuhia i roto i nga kiko kua wetewetehia.

——Tamatauhia etahi atu kakano.

Kua kore te A-6 PCR tauhohenga

——Mo te rua-taahiraa RT-PCR, ko te tauira cDNA i te taahiraa PCR e kore e neke ake i te 1/5 o te rahinga tauhohenga.

A-1 Te whakakotahitanga-kore mo nga tuatahi me nga tauira

—— Ko te mutunga 3'-o nga timatanga kaua e uru ki te 2-3 dG dC ranei. Whakamahia nga tuhinga tuatahi-a-Ira ki te waahanga tuatahi o te whenu, kaua ki nga timatanga tupurangi, oligo ranei (dT). Whakamahia te mahana whakamahana teitei ake i roto i nga huringa tuatahi, katahi ka pa ki te mahana te hono whakamoemiti. Whakamahia te-tiima Taq DNA polymerase mo PCR hei whakapai ake i te kiko o te urupare.

A-2 He ngoikore te hoahoa o nga tuatahi-whakapapa-ira

——A pee i nga kaupapa ano mo te whakarei i te hoahoa tuatahi.

A-3 RNA i poke i te DNA genomic

——Taria RNA me te PCR-tohu DNase I. Whakaritehia he uruparenga whakahaere me te kore e hurihuri whakamuri kia kitea te poke o te DNA.

A-4 Te hanga i te atarua tuatahitia

—— Hoahoa hoahoa tuatahi kaore he raupapa taapiri i te pito 3 '.

A-5 teitei rawa Mg²⁺ kukū

——Whakaaro Mg²⁺ te kukume mo ia tauira me te huinga tuatahi

A-6 Kua poke ki te DNA ke

—— Whakamahia nga tohutohu kore-rererangi me nga haurangi UDG.

A-1 He nui rawa te kiko o te hua whenu tuatahi

——Whakaitihia te nui o te hua whenu tuatahi i roto i te hikoi urupare PCR tikanga.

A-2 Tino teitei rawa te utu tuatahi i te hohenga PCR

——Titihia te whakaurunga tuatahi.

A-3 He maha nga huringa

——Whakaarahia nga tikanga urupare PCR ka whakaheke i te maha huringa PCR.

A-4 He iti rawa te mahana o te whakamomona

—— Whakarei ake i te pāmahana whakauru hei aukati i te tiimatanga-kore motuhake me te whakaroanga.

A-5 Te whakanui-kore i nga waahanga oligonucleotide i hangaia e te whakaheke o te DNase o te DNA —— Tangohia te RNA kounga-pai hei aarai i te poke o te DNA.

Ma te RT-PCR e huri te huri i te RNA ki te cDNA, ka whakamahi i te cDNA kua hurihia hei tauira mo te urupare PCR hei whakanui i te waahanga whainga. Tohua nga timatanga tupurangi, Oligo dT me nga ira motuhake motuhake kia rite ki nga tikanga motuhake o te whakamatautau. Katoa nga korero tuatahi i runga ake nei ka taea te whakamahi mo te mRNA iti o te eukaryotic kaore he hanganga makawe.

Tuatahi tupurangi: He pai mo te RNA roa me te hanganga makawe, tae atu ki nga momo RNA katoa penei i te rRNA, mRNA, tRNA, me etahi atu e whakamahia ana mo te urupare RT-PCR o te tauira kotahi

Oligo dT: He pai mo te RNA me te taatai ​​PolyA (te RNA prokaryotic, te eukaryotic Oligo dT rRNA me te tRNA kaore he hiku PolyA). Na te mea ko te Oligo dT e herea ana ki te hiku PolyA, ko te kounga o nga tauira RNA e hiahiatia ana kia teitei, a, ahakoa ko te iti o te whakaheke, ka tino whakaitihia te rahi o te whanui-roa o te cDNA.

Tuatahi whakapapa-motuhake: He taapiri ki te raupapa tauira, e tika ana mo nga ahuatanga e mohiotia ana te raupapa whaainga.

E rua nga huarahi:

1. Tikanga korero a-roto: Ki te ariā, ko te cDNA he waahanga DNA o nga roa rereke, na ko te hua o te electrophoresis he paraoa. Mena he iti te nui o te RNA, kaore he hua e puta i te hikohiko, engari ehara i te kii kaore he hua e whakarahihia e PCR. I te nuinga, ka taea te whakamahi i te tohutoro a roto kia kitea te cDNA. Mena he hua te tohutoro o roto, ko te kounga o te cDNA ka taea te pumau (i etahi keehi, mena he roa rawa te waahanga ira kua whaaia, tera pea he awangawanga).

2. Mena he ira e mohiotia ana kua whakarahihia e tenei tauira, ka taea e nga tiimatanga o tenei ira te whakatau. Ko te whakanui i te tohutoro o roto kaore i te kii kaore he raru o te cDNA. Na te mea he nui te tohutoro o roto i te cDNA, he ngawari ki te whakarahi. Mena kua whakaitihia te cDNA mo nga momo take, mai i te tirohanga o te tupono, ka tino pangia nga hua PCR o nga ira tino whaainga. Ahakoa he nui tonu te tohutoro o roto, kaore pea e raru te whakanui.

Te whakaheke i te waahanga o te RNA. Rapua te pono me te pure o te RNA

Ko nga tuhinga RNA o nga momo rereke ka rereke, engari i te nuinga, ko te RNA katoa i tangohia kia rua nga marama 28S me nga 18S kei roto i nga hiko electrophoresis, a ko te maama o te peene o mua kia rua teitei ake i era o muri. Ko te roopu 5S e tohu ana kua whakaitihia te RNA, a ko tona tiahotanga e haangai ana ki te tohu o te whakahekenga. Ko te whakarei angitu o te tohutoro o roto ehara i te kii kaore he raru mo te RNA, na te mea he nui te tohutoro o roto, ka taea te whakakaha i te RNA mena kaore i tino kaha te whakahekenga. Te OD₂₆₀/ OD₂₈₀te ōwehenga o te RNA parakore e whangangahia ana e te spectrophotometer, kei waenga i te 1.9 me te 2.1. Ko te iti o te poke o te pūmua i te RNA ka whakaheke i te ōwehenga. Mena kaore i te iti rawa te uara, kaore e raru te RT. Ko te mea nui mo te RT ko te pono RNA.

Ko te whakaroanga o te ira whakapapa o roto ka tohu noa kua angitu te RT, engari kaore e pa ana ki te kounga o te whenu cDNA. Na te mea ko nga kongakonga tohutoro o roto he iti te rahi me te kaha ki te whakaputa, he maama ake te angitu ki te tuhi whakamuri. Heoi, ko te rahi me te whakaaturanga o te ira whaainga he rereke mai i te ira ki tetahi ira. Ko te kounga cDNA kaore e taea te whakawa ma te korero a-roto anake mo nga waahanga whainga roa atu i te 2 kb.

Ko etahi tauira he uaua nga hanganga tuarua, he whai kiko GC ranei, he mea utu rawe ranei. I roto i enei keehi, me whiriwhiri he transcriptase whakamuri tika kia rite ki te rahi o te waahanga whainga me te tauira. Mo nga tauira RNA me te nui o nga korero GC me nga hanganga tuarua uaua, he uaua ki te whakatuwhera i te hanganga tuarua i te paemahana iti, ki te transcriptase whakamuri noa ranei. Mo enei tauira, Ka taea te whiringa Quant Reverse Transcriptase, na te mea he pai ake te pai o tana tuhinga whakamuri i tera o te raupapa M-MLV whakamuri transcriptase, ka taea te whakahoki i nga tauira tauira RNA me te whakawhiti i te RNA ki te cDNA whenu tuatahi ki te rahinga nui. A, no te whakamahi i te kete whakawhiti whakamuri whanui, ka taea e te punaha 20 μl te whakahoki tika i te 1 μg o te RNA katoa. Tena koa kia tupato ki te nui RT kaha o te kete. Mena ka taapirihia te tauira, ma te hurihuri whakamuri ka aro te RNA ki te tino tini. Na reira, he pai ake kia kaua e neke ake i te kaha o te punaha.

A-1 Me whakatau mena kua tino whakaitihia te RNA ana mena kua angitu te RT

I te nuinga o te waa, ko te take o te ngoikore o te whakahiki tohutoro a roto i te nuinga o te wa ka pa mai i te tino hekenga o te RNA. Ko tetahi atu take pea ko te koretake o te tuhinga. Kaore e taea te whakamahi i te tohutoro o roto hei paerewa hei whakawa i te kounga o te whenu kotahi cDNA, engari ka taea te whakamahi hei paerewa hei whakawa mena he angitu te tuhinga whakamuri mena kaore he raru o te kounga RNA. Ko te mea nui i te huringa tuhinga whakamuri ko te pupuri i te mahana tonu me te punaha tauhohenga kia pai ake ai te kaha o te tauhohenga.

A-2 Whakatauhia mena he pono nga mea tuatahi mo te whakarahi ake i nga ira tohutoro o roto, mena ka raru ana etahi reagents e whakamahia ana i te PCR.

Mo te taatai ​​tika, me tatau te RNA i mua i te hurihanga o muri, e hiahiatia ana hoki i roto i te maha o nga kete whakawhiti whakamuri, hei tauira, tatau i te whakauru RNA ki te 1 μg. Na te mea ko te cDNA kua whakamaorihia he rongoa whakauru, tae atu ki te RNA, te oligo dT, te whākōkī, te dNTP, tae atu ki te toenga DNA iti, ka puta ke te kotiti, no reira kaore e taea te tatau tika i te cDNA. No reira, he mea nui te tatau RNA. Ki te whakaaro ki te whaihua o te tuhinga whakamuri he orite ki nga tauira rerekee, ko te nui o te cDNA i whakawhiwhia kia orite, ka taea hoki e te wetewete rahinga te whakaatu i te whakataurite i nga taumata whakahua o nga ira rerekee i te rahinga o te RNA katoa. I te wa e mahi ana i te PCR rerenga nui, kaore pea e hiahiatia te cDNA i muri i te tuhinga whakamuri na te mea ka taea te tohu ira a-roto hei tohutoro.

Ko te nuinga e pa ana ki nga ira, ana ko te whakawhitinga whakamuri o te waahanga roa kaore e taea mo te nuinga o nga ira. Tuatahi, ko te whai huatanga o te whakahuri whakamuri he iti rawa atu i te PCR. Tuarua, ko te rohe momona o GC me te hanganga tuarua o te maha o nga ira ka aukati i te tuhinga whakamuri me te PCR. Hei whakamutunga, ko te pono me te kaha o te PCR he uaua ki te kii i te wa kotahi. I te wa o te whakawhitinga whakamuri, kaore e taea e tetahi te kii kia roa te waahanga mo nga ira kape iti, ina koa te whakamahi i te oligo dT. Mo te 5 'UTR me te maha atu o nga GC, he uaua ake. No reira, he tikanga tika tonu ki te whakahoki tuhinga me nga timatanga tupurangi, kitea nga waahi wehe o te taiao i roto i te waahanga whainga, whakarahihia e nga waahanga, ka mahi ai i te aukatinga me te whakapawai. I te nuinga, he uaua ki te whakakaha tika i nga waahanga nui atu i te 2 kb, engari kaore e taea te tiki i nga wa katoa: 1. Tuatahi, whakapumau i te pono o te RNA / mRNA, me te tangohanga TRIZOL. 2.M-MLV RT-PCR kete ka taea te whakamahi tika. Whakawhānuihia te taima whakapiri me te whakanui i te huringa huringa i roto i te mahinga whakarahi kia tika. Ano hoki, ka taea te whakamahi i te PCR ohanga, te mahi ranei kia rua, kia rua ranei nga urupare i te tuatahi me te totika o te whakaoratanga me te wa toronga i mua i te whakakaha o te PCR noa, ka awhina pea i nga waahanga. Kia tupato ki te pono o te polymerase. 3. Ka taea te whakamahi i te Taq roa i te PCR kia puta he hua pai. 4. Mo te whakamahinga o te whakahua i te pūmua, me whakamahi te polymerase pono teitei.

E rua nga momo tuhinga whakamuri kua tukuna e TIANGEN: Quant / King RTase me TIANScript M-MLV. Ko te rereketanga nui i waenga i a raatau ko te whakauru i nga tauira. Ko te Quant he transcriptase whakamuri ahurei, rereke i te M-MLV e whakamahia ana i ahu mai i te Moloney murine leukemia virus. Ko te Quant he transcriptase whakamuri hou-tino whai hua i whakaahuahia e te hangarau Escherichia coli. He pai te Quant hei whakanui i te 50 ng-2 μg o te RNA me te nui o te mahi whakawhitinga whakawhiti me te hua nui. Ka whakatauritehia ki te MMLV noa, ki te AMV ranei, ko te ahuatanga nui o Quant he tino hononga ki nga tauira RNA a ka taea te whakahoki i nga tauira tauira uaua me te kore e tino whakaheke te mahana. Mo nga tauira me nga korero GC teitei ake, he tiketike ake te mahi whakamuri. Heoi, ko tenei whakawhitinga whakamuri he mahi RNase H, ka raru pea te roa o te hua cDNA (e tika ana mo nga tauira <4.5 kb). Mo te tuhinga hurihuri tawhito, e taunakitia ana te TIANScript MMLV hurihuri whakamuri. Ko tenei RTase he hauropi whakarereke me te ngoikore ngoikore o te mahi RNase H, e pai ana mo te roa (> 5 kb) te whakahiato cDNA.

Ko te taahiraa whakamuri kotahi-taahiraa me te whakanui i te PCR kua oti i roto i te ipu kotahi me te kore e tuwhera i te taupoki ngongo i waenga i te kohinga cDNA me te whakanui, he pai hei whakaiti i te paru. Mai i nga tauira cDNA katoa i whakawhiwhia ki te whakamahi mo te whakanui, ka teitei ake te maaramatanga, me te iti rawa o te 0.01 pg o te RNA katoa. Mo te angitu o te taahiraa RTPCR, ka whakamahia nga tuatahitanga-motuhake ki te tiimata i te kohinga cDNA. Ko te tikanga e rua-taahiraa, ara ko te tuhinga whakamuri me te whakanui i te PCR e mahia ana i roto i nga waahanga e rua. Tuatahi ka hurihia te tuhinga whakamuri mai i te tauira RNA hei tiki cDNA, ana ko te cDNA i whakawhiwhia ki tetahi, neke atu ranei o nga urupare PCR. Ma te tikanga e rua-taahiraa e whakamahi te oligo (dT) me nga timatanga tupurangi ranei hei arahi i te waihanga o te whenu tuatahi o te cDNA, a ka taea te whakahoki i nga korero katoa o te mRNA mai i tetahi tauira motuhake.